برای جستجو در بین هزاران پایان نامه در موضوعات مختلف     

      و دانلود متن کامل آنها با فرمت ورد اینجا کلیک کنید     

 
دانلود پایان نامه

اهواز ملخ IRAN715C متاریزیوم آنیزوپلیه
107×4/2
109×4/2
1011×4/2
سراوان سوسک سرخرطومی حنایی خرما DEMI001 متاریزیوم آنیزوپلیه
107×4/2
109×4/2
1011×4/2
نور
M14 متاریزیوم آنیزوپلیه
3-2-2-2- کشت قارچ ها:
جهت کشت قارچ ها در شرایط استریل ابتدا سطح میز با پنبه الکل تمیز شد، سپس در کنار شعله به وسیله آنس فلزی مقداری از پرگنه های محیط منبع به محیط کشت منتقل شد. به این صورت از هر جدایه تعدادی کشت تهیه شد. کشتها برای 14 روز در انکوباتور 25 درجه نگهداری شدند، و از نظر رشد قارچ مورد بررسی قرار گرفتند.
3-2-2-3- تهیه سوسپانسیون کنیدیوم:
برای تهیه سوسپانسیون کنیدیومی، سطح محیط های کشت توسط آب مقطر همراه با توئین 80 (Tween 80) با غلظت 01/0 درصد شستشو داده شد. توئین 80 با کاهش کشش سطحی، باعث میشود کنیدیوم ها از محیط راحت تر جدا شوند. برای این منظور ابتدا سطح میز با پنبه الکل تمیز شد، سپس در کنار شعله مقدار کمی محلول توئین 80 در یکی از پلیت ها ریخته و سطح محیط کشت با استفاده از پیپت پاستور استریل که با حرارت مجرای آن بسته شده بود تراشیده و شستشو گردید. همین سوسپانسیون روی محیط دیگر ریخته شد و عمل تکرار شد. سوسپانسیون حاصله از 4 لایه گاز استریل گذرانده شد تا قطعات میسلیومها جدا شوند. از محلول صاف شده با استفاده از سمپلر یا پیپت پاستور برداشت و با استفاده از لام هموسیتومتر (نئوبار) اقدام به شمارش اسپور ها جهت تهیه رقت پایه (107 ×4/2 کنیدی در میلی‏لیتر) گردید.

3-2-2-4- تهیه اسلاید کالچر (Slide culture):
روش کشت روی لام برای کمک به شناسایی قارچ های رشتهای، که به سختی با روش تهیه تیزمانت شناسایی میشوند، انجام میشود. این روش در واقع روش مطمئنی برای تشخیص قارچ‏ های مختلف است چرا که بسیاری از قارچ ها را با توجه به شکل آنها در محیط های کشت و رنگ کلنی و پرگنه ها نمیتوان تشخیص داد. جهت تهیه اسلاید کالچر به ازای هر جدایه قارچی یک عدد لام و تعدادی لامل و یک لوله شیشهای U و یا V شکل در داخل پتریدیش قرار داده و مجموعه در اتوکلاو 121 درجه به مدت 15 دقیقه گذاشته شد. سپس محیط کشت آماده، توسط اسکالپل استریل به مربعهای مساوی و کوچک، حدود یک سانتیمتر مربع بریده شد و یک عدد از این قطعات روی لامی قرار گرفت و این لام روی لوله شیشهای U شکل درون پتری دیش قرار گرفت، با استفاده از آنس با رعایت شرایط استریل در زیر هود و در کنار شعله از هر کدام از قارچ های کشت شده به طور جداگانه برداشت و روی اضلاع قطعات فوق الذکر تلقیح گردید و در مرحله بعد لامل با کمی اعمال فشار روی قطعات تلقیح شده با قارچها قرار داده شد. این عمل برای 4 جدایه انجام گردید و مقداری آب مقطر استریل برای حفظ رطوبت و جلوگیری از خشک شدن محیط، به کف ظروف پتری اضافه گردید. کشت ها به مدت 14 روز در انکوباتور 25 درجه نگهداری شدند، و طی این مدت به طور مرتب با استفاده لوپ از نظر رشد قارچ بررسی شدند. پس از رشد و کنیدیوم زایی با استفاده از یک پنس، لامل موجود روی هر کدام از محیط ها به آرامی برداشته شد، یک قطره لاکتوفنل کاتن بلو روی لام دیگری قرار گرفت و لامل به آرامی روی لاکتوفنل به شکلی که حباب هوا تشکیل نشود قرار داده شد و سپس اقدام به مشاهده آنها در زیر میکروسکوپ گردید.
3-3- طرز آلوده کردن کنه ها با سوسپانسیون کنیدیوم قارچ:
کنه ها بلافاصله پس از رسیدن به آزمایشگاه در الکل اتیلیک70% ضد عفونی شدند. سالم بودن کنههای بالغ مهم بود و در اسرع وقت پس از جمع آوری مورد ارزیابی قرار گرفتند. کنه های صدمه دیده و تغییر رنگ داده حذف شدند. کنه های سالم دارای حرکت بودند و برای ارزیابی چنانچه کنه ها در زیر یک منبع نور قرار می گرفتند به سمت نور حرکت میکردند ]17.[
برای انجام آزمایش، سوسپانسیونی حاوی 107×4/2، 109×4/2 و 1011×4/2 کنیدیوم در هر میلی لیتر از هر کدام از 4 جدایه تهیه گردید و در یخچال با دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
برای هر جدایه قارچی سه گروه درمان (3 بارتکرار) از هر کنهی مورد آزمایش، در غالب گروههای 10 تایی کنه در نظر گرفته شد، هم چنین 30 عدد کنه به عنوان گروه کنترل منفی در سه گروه 10 تایی جای گرفتند که در مجموع تعداد 390 کنهی هیالوما مارجیناتوم بالغ مورد استفاده قرار گرفت.
در گروه های درمان، کنه ها به صورت انفرادی به وسیلهی پنس استریل 5-3 ثانیه در سوسپانسیون قارچی مربوطه و در گروه کنترل منفی نیز کنه ها 5-3 ثانیه در آب مقطر استریل همراه با توئین 80 بدون اسپور، غوطه ور شدند. پس از غوطه وری، کنه ها به پتریدیشهایی که حاوی کاغذ صافی (کاغذ واتمن) مرطوب بود منتقل گردیدند. سپس در ژرمیناتور با دمای 25 درجه سانتیگراد و رطوبت 70 درصد قرار گرفتند. لازم به ذکر است کاغذ های واتمن قبل از استفاده اتو کلاو شدند و هر روز پس از مطالعه کنه ها چند قطره آب مقطر استریل به کف ظروف جهت تامین رطوبت اضافه گردید.
تمامی گروه های مورد آزمایش به صورت روزانه، به مدت 20 روز مورد مشاهده و بازبینی قرار گرفتند و تلفات و رشد قارچ روزانهی آنها ثبت شد.

دسته بندی : علمی